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細胞凋亡的早期檢測方法有哪些?

更新時間:2019-06-28點擊次數:2197

1、PS(磷脂酰絲氨酸)在胞外膜分布的檢測
PS從胞膜內側轉移到外側現象是在細胞凋亡的早期即可發生標志。AnnexinV是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白,能專一性的結合暴露在胞膜外側的PS,使用熒光素標記的AnnexinV 蛋白(如Annexin V-FITC)即可檢測細胞凋亡。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。操作簡便快速,10分鐘就可完成檢測。靈敏度高,可作為流式方法分析凋亡細胞的基礎。

2、細胞內氧化還原狀態改變的檢測
正常狀態下,谷胱甘肽(GSH)作為細胞內的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而清除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被消化除。在細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時,細胞液就由還原環境轉為氧化環境,這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素C(三羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞液中,啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。

3、細胞色素C的檢測
細胞色素C作為一種信號物質,在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中,而不存在于胞漿內。凋亡信號刺激后可使其從線粒體釋放到胞漿中,結合Apaf-1后而啟動caspase級聯活化反應,先可激活caspase-9,后者再激活caspase-3和下游的其它caspase分子。凋亡發生的早期,細胞色素C泄漏到胞漿中,檢測胞漿中細胞色素c的含量可反映細胞的早期凋亡。

4、線粒體膜電位變化的檢測
在細胞凋亡的早期,線粒體在形態學上沒有明顯變化。但線粒體可發生很多生理生化的改變。例如在受到凋亡誘導后,線粒體的轉膜電位發生變化,導致膜穿透性改變。MitoSensorTM是一種陽離子染色劑,對此膜電位改變非常敏感,可呈現出不同的熒光染色。正常細胞中,它在線粒體中形成聚集體,發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中,因線粒體跨膜電位改變,它則以單體形式停留于胞漿中,發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。

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